這篇文章研究了天然抗癌藥物候選物綠原酸的直接蛋白質靶點和抗癌分子機制。

研究背景

1、綠原酸是一種天然產物，已被證明在許多臨床前模型中有效抑制腫瘤生長，并在中國進行了膠質瘤患者的II期臨床試驗。然而，CGA的直接蛋白質靶點和抗癌分子機制仍然未知。

2、確定綠原酸的直接蛋白質靶點具有挑戰(zhàn)性，因為許多天然產物通過非共價結合與其靶點相互作用，傳統(tǒng)的化學蛋白質組學方法難以捕捉這些相互作用。

3、活動性基于探針的蛋白質組學（ABPP）是一種結合了活動性探針（ABP）和蛋白質組學技術的方法，用于識別生物活性天然產物的蛋白質靶點，以幫助闡明其作用模式和副作用。

研究方法

1、設計并合成了一種新型的雙功能光親和探針PAL-綠原酸，基于綠原酸的結構-活性關系（SAR），包含了光親和性和富集手柄。

2、使用親和性蛋白質組學（AfBPP）化學蛋白質組學方法，通過多種檢測手段（如表面等離子共振（SPR）、等溫滴定量熱法（ITC）和冷凍電子顯微鏡（cryo-EM））對ACAT1/綠原酸相互作用進行了深入研究。

3、具體步驟包括：使用Sephadex G-200尺寸排阻柱和HiTrap™ Q HP陰離子交換柱對蛋白質進行純化和脫鹽，使用Thermo Fisher Titan Krios G3i電子顯微鏡進行cryo-EM單顆粒分析，使用Biacore T200系統(tǒng)進行SPR分析，以及使用EAQ-ITC儀器進行ITC分析。

實驗設計

1、通過MTT法評估綠原酸對A375細胞的細胞毒性，細胞在96孔板中以1×10^4細胞/mL的密度接種，在5% CO2條件下孵育12小時，然后在缺氧條件下以1.25-10 mmol/L的綠原酸濃度處理72小時。

2、使用HisTrap HP柱進行親和色譜純化ACAT1蛋白，并通過SDS-PAGE確認其純度。

3、通過熱位移試驗（TSA）和藥物親和響應靶穩(wěn)定性（DARTS）試驗評估綠原酸與ACAT1的結合穩(wěn)定性和親和力。

4、使用cryo-EM單顆粒分析研究ACAT1/綠原酸復合物的結構，數(shù)據(jù)在Thermo Fisher Titan Krios G3i電子顯微鏡上收集，使用MotionCor2進行圖像對齊和求和，使用CTFFIND4.1進行CTF估計，使用RELION3.1進行粒子挑選和分類。

結果與分析

1、綠原酸通過抑制ACAT1四聚體在Y407殘基上的磷酸化，從而抑制癌細胞增殖。

2、SPR分析顯示綠原酸與ACAT1的平衡解離常數(shù)（KD）約為2.58 mmol/L。

3、ITC數(shù)據(jù)顯示綠原酸與ACAT1的結合具有兩個位點，第一個位點的KD為9.68 mmol/L，第二個位點的KD為39.7 mmol/L。

4、cryo-EM結構顯示綠原酸通過氫鍵網絡穩(wěn)定地結合在ACAT1的四聚體上，綠原酸的咖啡酸部分暴露在ACAT1結構的外部，而奎寧酸部分位于變構位點。

5、在體外和體內實驗中，綠原酸顯著抑制了ACAT1的活性，減少了Y407的磷酸化，增加了丙酮酸脫氫酶（PDH）的活性，從而抑制了腫瘤生長。

總體結論

1、使用新型雙功能光親和探針PAL/綠原酸和AfBPP化學蛋白質組學方法，首次發(fā)現(xiàn)線粒體ACAT1是綠原酸的主要靶蛋白。

2、綠原酸通過非共價結合ACAT1四聚體，誘導廣泛的構象變化，導致Y407磷酸化的消除，從而降低ACAT1活性。

3、這種新的作用模式解釋了綠原酸的臨床益處，并為未來的臨床應用提供了新的見解。

這篇文章通過詳細的實驗設計和多種生物化學技術，揭示了綠原酸作為ACAT1抑制劑的分子機制，為綠原酸在癌癥治療中的應用提供了新的理論基礎。

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